생물학적인 데이터를 얻어내는 기술은 바이오 정보를 수집하고, 질병을 예방하고 진단하는 면에서 매우 중요하다. 최근 바이오 분석 시스템은 다량의 시료를 처리할 수 있도록 어레이화 및 소형화 되어 가고 있다[1]. 반도체 공정을 이용하여 여러 분야에서 사용될 수 있는 바이오 칩이 많은 발전을 하였다. 바이오 센서와 전기적 특성을 이용하여 세포의 특징 및 의학 진단에 도움이 되는 연구가 진행되고 있다. 이러한 바이오 분석 시스템 중 임피던스 바이오 센서는 단순하고 민감하며 휴대 가능한 장치로 사용될 수 있다[2]. 또한, 즉각적인 모니터링이 가능하고 약물 반응에 따른 전기적 특성의 변화와 세포의 상태를 측정할 수 있다[3]. 세포를 이용한 임피던스 바이오센서를 제작할 때는 생체적합성 재료의 선택과 세포로부터 나오는 신호를 처리하는 기술 등의 핵심요소기술이 요구된다[4]. 세포-기질 전기 임피던스 분석법(Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS)은 세포를 비파괴/실시간으로 측정하는 기술 중 하나이다[5]. 특정 단백질, 세포 수용체, 세포의 수 등 다양한 반응의 변화 정도를 식별하여 전기적인 신호로 모니터링 하는데 사용되고 있다[6]. 임피던스 측정의 경우 높은 주파수부터 낮은 주파수까지 넓은 범위에서 약한 교류 사인 신호를 센서에 인가해 이에 따른 간격과 위상의 변화를 측정한다[7]. 전기 임피던스의 측정 민감도는 전극에 의해서 분포된 전기장이 세포에 의해서 얼마나 교란되는지에 의해서 결정된다[8].

임피던스 바이오센서의 경우, 민감도 향상을 위하여 많은 연구들이 진행되고 있다. 질병 및 진단을 위한 의료 산업, 생화학 무기를 감지할 수 있는 군사분야, 식중독균의 검출을 위한 식품분야 등 바이오 센서의 높은 민감도를 필요로 하고 있다[9-11]. 민감도 향상을 위하여 전도성 고분자를 이용한 바이오센서나 광학 바이오센서 등 다른 분야들을 접목시키거나, 바이오 센서에 사용되는 전극의 종류, 재질, 면적 등 전극 자체에 변형을 주었다[12,13]. 이처럼 차세대 바이오센서를 위한 연구개발에 집중하고 있다.

본 연구에서도 바이오센서의 민감도와 주파수 의존도에 대해 알아보기 위해 선행 연구에서 진행하였던 300 μm 패턴의 임피던스 바이오 센서를 사용하였다. 전극 패턴의 너비와 간격에 변형을 주어 기존의 300 μm를 기준으로 163, 211 그리고 518 μm 패턴의 바이오센서를 제작하였다. 이 때 임피던스 값은 세포의 저항(R_세포)과 정전용량(C_세포)의 정보 등을 제공하며[14], 본 실험에서는 세포의 성장과 약물 반응을 통한 정전용량의 변화를 관찰하였다. 제작된 센서로 정전용량-주파수와 정전용량-시간 데이터를 측정하여 주파수 의존도를 갖는지 확인하였다. 우리 그룹의 선행 연구에서 NIH/3T3 세포를 이용한 임피던스 바이오센서의 정전용량-주파수와 정전용량-시간에 대한 분석이 잘 드러나 있다. 시간대별 세포의 성장과 사멸하는 모습에 대한 정전용량의 변화도 자세히 볼 수 있다[15]. Figure 1이 제작한 바이오 센서로 ECIS기술을 사용하여 실시간으로 정전용량의 변화를 모니터링한 데이터이다. 세포의 성장 과정에서는 세포의 개체 수와 크기가 증가하면서 정전용량이 증가하는 양상을 보였다. 48시간 이후 약물을 주입 후 세포의 사멸과 크기가 작아지면서 정전용량도 감소하는 것을 관찰했다. 이를 기반으로 세포에 따라 적절한 패턴 크기 디자인과 민감한 데이터를 얻기 위하여 적절한 주파수 설정의 중요성에 대하여 연구하였다.

Figure 1. (Color online) Measured capacitance about Cell growth and drug reaction.

Figure 2는 반도체 공정으로 바이오 센서를 제작한 과정을 보여준다. 슬라이드 글라스에 양성 감광막(Positive PR, AZ 5214)을 도포 하였으며 스핀 코팅기로 4000 rpm으로 35초간 진행하였다. 도포 후, 가열판(Hot plate)에 100 °C에서 10분간 베이킹을 진행하고. 베이킹이 끝나면 슬라이드 글라스가 식을 때까지 3분 기다렸다. 금속 패턴을 형성하기 위해 슬라이드 글라스와 크기가 동일한 마스크를 사용하였으며, Fig. 3 같이 163, 211, 300, 518 μm의 너비와 간격을 갖는 교차 전극으로 제작되었다. 너비와 간격의 비율은 1:1이며, 이때 교차 전극은 24.51 mm²의 동일한 면적 내에서 각각 13.0297, 13.2365, 13.62, 14.9095 mm²을 차지하였다. 제작한 마스크를 슬라이드 글라스 위에 올려 접촉 노광기(Contact Aligner, EVG 610)로 노광하였다. 현상을 위해 현상액(AZ 300 MIF Developer)에 50초간 담구어 현상하였다. 양성 감광막으로 패턴 작업이 끝난 후 패턴에 금속을 증착하기 위해 사용한 장비는 알에프/직류 마그네트론 스퍼터(삼한진공, SHS-2M3-40T)이며, 스퍼터 챔버 내부 압력이 5 × 10^-6 torr까지 형성되면 물리적 박막 증착(Physical Vapor Deposition, PVD) 공정을 진행하였다. 패턴은 생체적합성에 우수한 Pt(platinum)를 증착하였고, Pt와 슬라이드 글라스의 접착력을 향상시키기 위해 Pt전에 Cr(chromium)을 쌓아주었다. 스퍼터링 과정 전에 타겟에 있을 수 있는 이물질을 제거하기 위해 전처리-스퍼터링을 먼저 진행하였다. 전처리-스퍼터링을 위해 Ar gas를 25 mtorr 주입한 후 교류 전력을 50 W 가했고 Cr 타겟를 열어 플라즈마가 뜨는지 확인하고 타켓의 이물질을 제거하였다. 그 후, Ar gas 5 mtorr를 주입하여 스퍼터링 환경을 조성하였다. 가스 주입량이 맞춰지면 Cr을 30초간 5 nm 증착하고 Cr 이후 동일한 방법으로 Pt를 1분 30초동안 80 nm 증착하였다. 금속 박막을 슬라이드 글라스 전면에 증착했기 때문에 패턴 부분을 제외하고 박막을 제거하기 위해 아세톤 용액에 3분간 초음파 세척기를 이용하여 리프트-오프를 진행하였다. 퍼니스(Furnace 삼한진공, SHTC-3000)에 슬라이드 글라스를 넣어주고 Ar gas, 1 torr, 400 °C 조건에서 1시간 열처리를 진행하였다. 열처리가 잘 됐는지 확인하기 위해서 공정 전후에 저항을 측정하였다. 평균적으로 300 μm 패턴 기준, 열처리 전의 짧은 패턴의 저항은 2.95 KΩ이며, 긴 패턴의 저항은 3.31 KΩ이다. 열처리 후의 짧은 패턴의 저항은 1.86 KΩ이며, 긴 패턴의 저항은 2.510 KΩ으로 열처리 공정 후, 저항이 감소한 것을 확인하였다. 그리고 패턴의 패드 부분을 장비와 전기적으로 연결하는 부분인 패드를 형성하기 위하여 열 증착기 (Thermal Evaporator 삼한진공, SHE-6T-350D)를 사용하여 Al(Aluminum)을 패드 부분에만 200 nm 증착하였다. 마지막으로, 측정을 위해 센서의 패드 부분과 다중 커넥터(Multi Connector)를 연결해야 하므로 0.16 mm의 심선과 0.32 mm의 단선을 갖는 테프론 와이어를 사용하였다. 센서의 패드와 테프론 와이어를 잘 접촉시키기 위하여 실버 페이스트를 도포하였다.

Figure 2. (Color online) The process of manufacturing impedance biosensors (a) and seeding cells (b).

Figure 3. (Color online) Pattern width and spacing variations of impedance sensors.

위와 같은 제작 과정을 통해 만들어진 임피던스 바이오센서에 세포를 배양하기 위해 용이한 PDMS(Polydimethylsiloxane) 웰(Well)을 패턴에 형성하였다. (Fig. 2 참고) 이 후 PDMS 웰 내부에 세포를 분주하기 전 오염을 방지하기 위해 EtOH 70%로 웰 내부를 멸균해주었다. 이 후 세포와 슬라이드 글라스의 접착력을 높이기 위하여 Poly-L lysine으로 40분동안 코팅을 진행하였고, 자외선을 40분 동안 조사한 뒤 24시간 건조하여 세포가 자랄 수 있는 환경을 조성해 주었다. 그 다음 웰 내부에 배지와 함께 10000개의 세포를 분주하였다. 이때 사용한 세포는 NIH/3T3이며, 쥐의 배아세포로 섬유아세포 타입이다. 처음 분주 할 때의 크기는 약 20 μm로 세포가 완전히 성장하면 가장 긴 부분이 약 100 μm까지 커지고, 사멸하면 18 μm로 세포의 크기가 감소한다. 배지는 DMEM(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium)에 Calf serum 10%, AB(Penicillin/Streptomycin) 1%를 첨가하여 사용하였다. 이 후 바이오센서들을 인큐베이터 안에 넣어 성장하는 과정을 48시간 동안 측정하였다. 웰 내부에 세포가 가득 자라면 웰 내부에 있는 기존 배지를 100 μL 정도 제거하고, 단백질 합성을 억제해 세포를 사멸에 이르게 하는 약물인 퓨로마이신을 배지와 10 μg/mL로 희석하여 200 μL를 넣어주었다. 이로써 총 웰 내부의 약물농도를 5.72 μg/mL로 맞춰주어 세포가 사멸하는 과정을 48시간동안 측정하였다. 정전용량-주파수 데이터는 1 kHz–1 MHz사이의 주파수 변화로 매 1시간의 간격으로 모니터링하였고, 정전용량-시간 데이터는 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 kHz에서 매 10분간의 간격으로 모니터링하였다. 임피던스 바이오센서를 측정하는데 사용된 장비로는 인큐베이터(Thermo Electron corporation), Keithley 4200A-SCS, Agilent 4284와 Keithley 707B Switching matrix를 사용하였다.

Figure 2 에서 설명한 샘플 제작과정을 통하여 Fig. 3과 같이 163, 211, 300 그리고 518 μm의 패턴 너비와 간격 별 임피던스 바이오 센서를 제작하였다. 임피던스는 주파수에 의존하기 때문에 측정 주파수의 범위를 선정하는 것이 중요하다. 따라서 바이오센서의 민감한 주파수 영역대를 찾기 위하여 1 kHz–1 MHz사이에서 주파수 휩씀(sweep)을 하여 정전용량-주파수 데이터를 측정하였다. 바이오 실험에서 필연적으로 생기는 오차를 줄이고, 재현성을 확인하기 위해 각 패턴 별 총 5회 측정하여 얻은 데이터를 평균내었다. 이 후 주파수 별 시간에 따라 측정된 정전용량, C(t)를 초기 상태인 0시간에서 측정된 정전용량, C(0)로 나눠 가장 변화의 폭이 큰 주파수 대역을 확인하였다. Figure 4는 앞에서 설명한 방식으로 정전용량을 나눠 너비/간격 별 센서의 민감한 주파수 대역 보여주는 그래프이다.163, 211 μm의 센서에서는 441–489 kHz, 300 μm는 367–441 kHz, 518 μm는 221–274 kHz 사이에서 가장 민감한 주파수 영역대를 관찰하였다. 세포의 성장과정과 약물 반응 과정에서 모두 동일한 민감한 주파수 대역을 갖음을 확인하였다.

Figure 4. (Color online) The most sensitive frequency range according to pattern width and spacing in growth (left) and drug (right). (a) 163 μm, (b) 211 μm, (c) 300 μm (d) 518 μm

Figure 5는 Fig. 4 에서 제시한 너비/간격 별 센서의 민감한 주파수 영역대를 하나의 데이터로 볼 수 있게 나타내었고, 이 후 선형 피팅을 통해 너비/간격과 주파수 관계를 확인하였다. 패턴의 너비와 간격이 증가할수록 낮은 주파수 영역대에서 민감하다는 것을 실험을 통하여 알 수 있었다. 현재 ECIS 기법으로 측정하는 임피던스 바이오센서에서 너비/간격과 주파수 상호관계에 정확한 모델이 없어, 가장 간단한 유추로 실험에 활용하기 위하여 선형적인 변화를 가정하였다. 선형 피팅을 한 결과 너비/간격이 1 μm 증가할수록 민감한 주파수가 0.6442 kHz 감소하는 관계를 확인하였다. 이는 임피던스 식을 통하여 주파수와 너비/간격에 따른 의존도를 알 수 있다. Equation (1)은 임피던스에 대한 식으로 임피던스가 주파수와 정전용량에 의존하는 것을 보여준다. Equation (2)는 주파수에 대한 식으로 정전용량에 영향을 받으며, 정전용량은 Eq. (3)처럼 면적, 거리에 따라 의존한다[16].

Figure 5. (Color online) Comparison of the most sensitive frequency range about the pattern size.

세포와 전극, 세포와 세포, 세포와 배지 간의 거리는 필연적인 오차를 제외하고 모든 센서 별로 동일할 것으로 예측된다. 그러므로 민감한 주파수에 영향을 주는 요인은 전극의 면적으로 볼 수 있다. 전극의 면적은 너비/간격에 따라 달라지며, 163, 211, 300, 518 μm의 전극의 면적 크기는 13.0297, 132.2365, 13.62, 14.9095 mm² 이다. 163 μm를 기준으로 1 : 1.02 : 1.045 : 1.14 의 비율을 갖는다. 전극의 너비/간격에 따라서 전극의 면적이 달라지며, 전극의 너비/간격이 좁을수록, 면적이 커질수록, 민감한 주파수 영역대가 낮아지는 것을 확인하였다. 이 후 정전용량-주파수 데이터로 얻어낸 민감한 주파수 영역대에서 세포의 성장, 개체 수 증가와 약물반응에 따라 정전용량 변화량이 반영되는지 확인하기 위하여 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 kHz에서 정전용량-시간을 측정하였다. Figure 6은 전극의 너비/간격 별 민감한 주파수 영역대와 그 범위 외의 주파수 대역 100 kHz와 800 kHz 에서 시간에 따른 정전용량 변화량을 비교한 것이다. 각 센서의 민감한 주파수 영역대에서는 정전용량의 변화량이 세포의 성장, 개체 수 증가와 함께 선형적으로 증가하고, 약물 반응에 따라 감소하는 것을 관찰했다. 민감한 주파수 영역대보다 낮은 100 kHz에서는 높은 정전용량의 값을 보여주었으나, 세포가 성장하는 0시간에서 48시간 동안 세포의 성장과 개체수 증가하는 부분과 달리 센서의 정전용량 변화량은 비선형적으로 증가함을 보여주었다. 민감한 주파수 영역대보다 높은 800 kHz에서는 정전용량이 세포의 성장에 따라 선형적으로 증가하고, 약물 주입 후 감소하는 양상을 보였으나, 대부분 측정된 정전용량이 음수 값을 띄는 것을 확인했다. 음수 값을 띄는 것은 세포가 축전기로서 역할을 하지 못하는 것으로 볼 수 있다. 본 실험에서는 측정 장비와 임피던스 바이오센서를 연결할 때 테프론 와이어를 사용하였다. 한 번 측정 시 최대 6개의 바이오센서를 측정할 수 있으며, 센서 하나당 테프론 와이어가 2개씩 필요하게 된다. 한 번 측정 시 다중 커넥터에 연결되는 테프론 와이어는 총 12개 이며, 고주파수에서 측정 시 12개의 테프론 와이어들의 간섭으로 인덕턴스가 발생 할 수 있다. 인덕턴스와 커패시턴스의 관계식을 보면 Eq. (4)과 같이 임피던스의 값은 실수부(resistance, R)와 허수부(reactance, X)로 구성되며, 허수부는 Eq. (5)처럼 인덕터(유도성)와 커패시터(용량성) 두 가지 형태로 표현할 수 있다. 인덕터는 커패시터와는 반대로 전류의 위상이 인가된 전압에 비해 -90°만큼 차이나는 특성을 갖는다.

Figure 6. Capacitance-Time data measured within sensitive frequency range (center) and out of range (left), (right) about width and spacing. (a) 163 μm, (b) 211 μm, (c) 300 μm, (d) 518 μm

이처럼 주파수의 증가로 정전용량의 영향보다 인덕터에서의 영향이 커져 위상차이로 인해 정전용량이 음수의 값이 측정되었다[17]. 세포의 정전용량의 변화로 성장과정과 약물반응을 나타낸 그래프 개형도 중요하지만, 바이오 센서가 세포 하나하나의 정전용량 값을 정확하게 반영하는 것이 매우 중요하다. Figure 7에서는 각 너비/간격 별 정전용량-주파수 데이터로 얻은 민감한 영역대에서 정전용량-시간 데이터로 정전용량의 변화량을 비교해 본 결과이다. 163, 211 μm는 450 kHz, 300 μm는 400 kHz, 518 μm는 250 kHz에서 측정된 정전용량-시간 데이터를 겹쳐보았다. 그 결과 4가지 패턴 모두 정전용량 변화량의 차이가 거의 없음을 보여준다. 이를 확인하기위해 약물 투여 후 제일 높은 최고점에서 세포 사멸 후 최저점에서의 정전용량 변화 값을 확인하였다. 163 μm의 경우 13.1 pF, 211 μm는 16.0 pF, 300 μm는 18.2 pF, 518 μm는 20.8 pF의 변화량을 차이를 보였다. 약물 투여 후 정전용량의 변화량은 163 μm 를 기준으로 1 : 1.22 : 1.39 : 1.58 의 비율이며, 바이오 실험의 필연적인 오차를 생각하면 각 너비/간격 별 바이오센서의 세포 정전용량의 변화량이 비슷하다고 볼 수 있다. 따라서 본 실험에서는 163과 211 μm 센서는 411–489 kHz, 300 μm는 367–440 kHz, 518 μm는 221–274 kHz에서 측정이 이루어졌을 때 다른 주파수에서보다 정확한 정전용량 값이 측정되는 것을 알 수 있었다. 이 후 민감한 주파수 영역에서 정전용량을 비교하였을 때, 센서의 너비/간격에 따라서 세포의 성장과 약물 반응에 따른 변화 값이 큰 차이가 나타나지 않았다. 임피던스 바이오센서의 전극이 세포의 크기와 비슷한 너비/간격을 갖을 경우, 민감한 주파수 영역 안에서 측정이 이루어질 때 최적화된 정전용량 값을 얻을 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과로 임피던스 바이오센서를 이용하여 측정할 때 전극의 너비/간격에 따라 민감한 주파수 영역이 달라짐을 알 수 있었다. 또한 임피던스 바이오센서가 민감한 주파수 영역대에서 측정이 이루어질 때 다른 주파수에서 보다 정확한 측정이 이루어짐을 확인하였다. 이는 ECIS 기법을 기반으로 임피던스 바이오센서를 측정할 때 주파수 선정의 중요성과 전극의 너비/간격과 주파수와의 상호관계를 제시하였다.

Figure 7. (Color online) Comparison of Capacitance-Time graph about the pattern size.

본 연구에서는 바이오 임피던스 측정 시 민감한 주파수 영역대가 임피던스 센서의 패턴 너비와 간격에 의해서 의존도를 보이고 있는지 알아보는 실험을 진행하였다. 반도체 공정으로 제작된 임피던스 바이오 센서에 NIH/3T3 세포를 이용해 측정하였다. 정전용량-주파수 데이터로 각 너비마다 민감한 주파수 영역대를 알 수 있었고, 정전용량-시간 데이터로 세포의 성장과 개체수 증가에 따라 정전용량의 변화량이 측정되는지 확인할 수 있었다. 그 결과 163과 211 μm 센서는 411–489 kHz, 300 μm는 367–440 kHz, 518 μm는 221–274 kHz에서 민감한 주파수 대역을 확인하였다. 이 후 정전용량-시간 데이터를 측정하여 다른 주파수보다 민감한 주파수 대역에서 측정된 정전용량의 값이 보다 정확하게 측정된다는 것을 확인하였다. 또한 패턴의 너비와 간격이 증가할수록 민감한 주파수 영역대가 감소함을 확인할 수 있었다. 이로 인해 패턴의 너비와 간격에 따라 민감한 주파수 영역에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 세포 임피던스 측정 민감도 향상을 위해 측정 주파수 범위가 적절하게 선택되어야 하며, 민감도 향상을 위해 전극 너비와 간격에 대한 최적화된 설계가 필요하다는 것을 보여주었다.