npsm 새물리 New Physics : Sae Mulli

pISSN 0374-4914 eISSN 2289-0041
Qrcode

Article

Research Paper

New Phys.: Sae Mulli 2022; 72: 835-840

Published online November 30, 2022 https://doi.org/10.3938/NPSM.72.835

Copyright © New Physics: Sae Mulli.

Effects of Pulse Magnetic Field on T Cells

Juyeon Jung, Hyunsook Lee*

Department of Digital Helthcare, Sangji University, Wonju 26339, Korea

Correspondence to:*E-mail: hslee@sangji.ac.kr

Received: September 28, 2022; Revised: October 13, 2022; Accepted: October 13, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License(http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

T cells are lymphocytes that are responsible for antigen-specific adaptive immunity, cellular immunity, and homeostasis maintenance in the human body. However, immune T cells do not function properly in T lymphoma, a malignant tumor that occurs in lymphocytes, such that cancer cell proliferation and metastasis become active. Therefore, in this study, the effect of a pulsed magnetic field (PMF) on the regulation of pH homeostasis and proliferation rate of T lymphoma cells was investigated by using mouse EL4 cells. The restoration of extracellular pH homeostasis to the normal pH range of 7.35-7.45 was faster in EL4 cells stimulated with PMF for 24 h than in the control group. Moreover, homeostasis recovery increased rapidly as the magnetic field strength was increased. In addition, the number of T lymphoma cells decreased in the PMF stimulus group relative to that in the control group. PMF stimulus might induce the natural death of T lymphoma cells. Therefore, our study confirmed that PMF stimulation helps improve cancer treatment and balance immunosuppression and activity.

Keywords: Pulsed magnetic field, Immune cell, Extracellular pH, Homeostasis, EL4 cell

T세포는 항원 특이적인 적응 면역을 주관하는 림프구로 세포성 면역을 담당할 뿐만 아니라 인체 내 항상성 유지에 관여한다고 알려져 있다. 그러나 백혈병에 감염되어 면역 T세포가 제 기능을 발휘하지 못하면 림프구에 발생하는 악성종양인 T림프종 세포가 발달하게 됨으로써 면역기능에 손상을 줄 수 있다. 따라서 본 연구에서는 마우스 EL4 세포를 이용하여 T 림프종 세포의 pH 항상성 조절과 세포증식률에 대한 펄스자기장의 효과를 규명하였다. EL4 세포에 펄스자기장을 인가하고 24시간 이후 세포외 pH가 펄스자기장을 가하지 않은 대조군의 pH보다 정상 pH 범주인 7.35-7.45로 더 빨리 항상성을 회복하는 것을 관찰하였으며 자기장의 세기가 증가할수록 항상성 회복속도가 빨라지는 것을 확인하였다. 또한 T 림프종 세포수가 대조군에서 보다 펄스자기장 자극군에서 감소하는 것을 관찰함으로서 펄스자기장 자극이 T림프종 세포의 자연사를 유도하는 것으로 판단된다. 그러므로 펄스자기장 자극은 암치료에 대한 개선 효과를 보이고 면역억제와 활성의 균형을 유지하는데 도움을 준다는 것을 확인하였다.

Keywords: 펄스자기장, 면역세포, 세포 외 pH, 항상성, EL4 세포

항상성은 다양한 외부자극에 반응하여 개체와 세포의 상태를 일정하게 유지하려는 성질로 대부분의 생명 현상은 체온, 혈중농도, 삼투압, pH 조절 등을 통해 이루어지는 항상성 유지와 관련되어있다. 그 중에서도 생체 내 산-염기 균형을 통한 항상성 유지는 모든 생명에 있어서 아주 중요한 지표이다. 이산화탄소와 물이 결합한 탄산과 중탄산염이 폐를 통한 호흡과 신장기능 조절에 의해 혈액의 pH가 변화하면서 체내의 산-염기 항상성을 유지하는데 만약 중탄산염과 탄산이 일정수치보다 많거나 적어지면 산-염기 불균형을 초래한다[1]. 이러한 산-염기 불균형이 지속되면 대사성 산증 또는 대사성 알칼리증, 호흡성 산증과 알칼리증 등의 질병을 야기하며 심하면 패혈증으로 인한 사망으로 이어질 수 있다[2].

세균, 바이러스와 같은 외부물질로 인해 항상성 불균형이 생기면 항상성을 조절하기 위해 생체 내에서 병원체를 구분없이 공격하는 비특이적 면역세포, 구분해서 공격하는 특이적 면역세포들의 활성과 같은 다양한 면역반응이 일어난다. 이러한 면역반응을 자세히 살펴보면 비특이적 면역으로 식균작용을 하는 대식세포와 비정상적인 세포를 공격하는 자연살해세포(Natural Killer cell, NK cell)가 활성화되고 특이적 면역으로 특정한 병원체를 구분하거나 기억해서 공격하는 T세포와 B세포가 활성화된다[3]. 이때 면역체계에 이상이 생기면 체내의 기능 손실에 의해 자가항원에 대한 항체를 생산하는 병인 자가면역 질환이 일어나고 만성염증으로도 이어질 수 있다. 과도한 염증반응으로 인한 만성염증은 염증반응에서 분비되는 화학물질인 인터루킨(interukin)과 같은 염증성 사이토카인이 정상 세포의 DNA 구조를 손상시켜 암이 유발된다고 알려져있다[4].

특이적 면역에서 도움 T세포, 기억 T 세포, 살해 T 세포 등과 같은 다양한 기능을 수행하는 T 세포는 혈액 내에서 대부분 비활성 상태로 존재하고 있지만 T림프구 항원 수용체인 TCR (cell antigen receptor)이 항원보유세포의 MHC class Ⅱ(major histocompatibility complex, MHC)분자에 결합하여 신호를 세포로 전달하면서 면역에서 핵심적인 역할을 하는 T세포가 활성화 된다. T세포는 암세포와 같은 변이된 세포의 자연사를 유도해 항암효과를 높인다. 이때 T세포의 활성화 수준이 매우 낮으면 외부 침입에 의한 감염에 취약해지지만 반대로 과도하게 활성화되면 자가면역질환과 만성염증의 원인으로 작용할 수 있어 면역반응의 억제와 활성 간의 균형 조절은 매우 중요하다. 따라서 T세포가 기능을 제대로 수행하지 못하면 암세포의 증식과 전이가 활발해지기 때문에 암과 같은 외부물질이 침입했을 때 T세포의 역할이 매우 중요하다고 알려져 있다[5,6].

자기장 자극은 인체 내 세포의 이온을 활성화시키고 유도 전류의 세포 자극으로 인해 비침습적인 치료가 가능하여 오랜기간 연구되어 왔으며 근육 및 신경질환치료 등에 다양하게 쓰이고 있다[7]. 정자기장은 세포의 ALP(Alkaline phosphatase) 및 DNA 활성도에 영향을 미쳐 골세포의 대사과정에 변화를 줄 수 있을 것이라고 보고되어있으며 자기장에 따라 진동하는 나노입자를 이용해 암세포를 가열해 사멸시킬 수 있는 교류자기장의 연구 또한 활발하게 진행되고 있다[8,9]. 또한 교류자기장에서 암세포의 증식률 억제 및 세포자연사의 관찰에 대한 연구도 진행된 바 있다[10,11]. 펄스자기장(PMF : pulsed magnetic field)에 관련된 선행연구를 살펴보면 적절한 펄스자기장이 적혈구 막의 변형성을 결정하는 요인인 Ca2+ 이온 통로에 영향을 주어 적혈구의 응집성과 변형성에 긍정적 영향을 줄 뿐만 아니라 펄스자기장이 세포막의 Na+/H+ 펌프에 영향을 주어 H+이온 변화에도 영향을 미칠 것으로 보고되었다[12].

따라서 본 연구에서는 백혈병이 유도된 암세포주인 EL4 세포를 이용해 펄스자기장 자극 전후 pH를 측정하여 산-염기 항상성 조절의 가능성을 확인하고 펄스자기장이 마우스 림프종 EL4 세포의 증식률에 미치는 영향을 조사하고자 한다.

1. 세포 준비 및 배양

EL4 세포는 C57BL mouse에 9,10-dimethyl-1,2-benzanthrance 물질을 유도하여 백혈병에 감염된 T세포로 면역학 연구에 in vitro(생체 외) 모델로 이용되고 있으며 부유세포로 배양에 용이하고 증식 또한 빠르게 나타나 연구에 적합하다고 알려져있다. 따라서 본 연구에서는 펄스 자기장에 따른 세포의 증식률과 pH를 조사하기 위해 EL4 세포를 한국 세포주은행으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. EL4 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin이 포함된 Dulbeco’s modified eagles’s medium (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용하여 cell culture flask에 5.5 × 104 cells/mL 농도로 37 °C, 5% CO2 환경인 incubator에서 배양했으며 2-3일 간격으로 계대배양을 실시하였다. Figure 1은 incubator에서 18시간 동안 배양된 EL4 세포의 모양을 관찰한 사진이다.

Figure 1. (Color online) Morphology of EL4 cell cultured in incubator of 37 °C and 5% CO2.

2. 펄스자기장 자극에 따른 pH 측정

세포막에서 이온 간의 교류가 활발해지고 염증매개체 방출로 인해 세포외 배지(EM : extracellular media)의 환경이 충분히 변화하는 시기는 세포의 doubling time으로 알려져 있으므로 본 연구에서는 EL4 세포의 doubling time인 18시간을 모든 sample의 배양시간으로 정하였다. 펄스 자기장의 혈류개선속도 향상, 적혈구 응집성 개선 등과 같은 선행연구에서 최적의 자기장의 조건(세기 2700 G, 자극시간 3분)과 동일하게 배양된 세포에 자극하였다. Figure 2(a)에서 준비된 것처럼 자기장을 자극한 바로 직후, 자기장이 세포막의 이온통로에 영향을 미칠 수 있는 적응시간을 주기 위해 2시간 후, 중간지점인 5시간, 세포수가 두배가 되는 시점인 18시간, 그리고 24시간이 지난 후의 샘플 그룹에서 각각 EM에서의 pH 변화를 측정하였다. 펄스자기장을 자극한 후 pH 항상성 회복 효과가 가장 뚜렷하게 나타나는 시기를 확인하고 pH 항상성 회복 효과의 극대화를 위한 자기장 세기의 최적화 조건을 확인하기 위해 Fig. 2(b)에서 준비된 것처럼 PMF 실험군에 각각 1000 G, 2700 G, 4000 G의 세기를 갖는 펄스자기장을 가하였다. 모든 실험에서 펄스자기장의 일정한 자극을 위해 Fig. 3과 같이 cell culture flask를 코일 정중앙에 놓고 1.6 cm 떨어진 곳에서 인가하였다[13,14]. EM의 pH는 pH meter(pH/ Ion meter S220, METTLER TOLEDO)로 측정하였으며 측정 시, 온도는 일정하게 25 °C에서 유지하였다[15].

Figure 2. (Color online) Sample groups of EL4 cells classified according to treatment methods. The pH was measured as (a) elapsed times that 0 h, 2 h, 5 h, 18 h, 24 h after PMF stimulation of 2700 G, and (b) different PMF intensities of 1000 G, 2700 G, 4000 G, respectively.

Figure 3. (Color online) Schemetic diagram of pulsed magnetic field stimulator system. A cell culture flasks were positioned 1.6 cm above from the center of the coil.

3. 세포 수 측정

pH 항상성 회복 실험 결과에 대한 유의성 검정을 위해 세포 수 측정을 통한 세포의 증식률을 확인하였다. Figure 4와 같이 대조군과 펄스자기장 후의 실험군으로 나누어 세포 수를 측정하였으며 자기장의 세기는 pH 측정을 통해 항상성 회복에서 가장 뚜렷한 효과가 나타난 4000 G로 고정하여 진행하였다. 정확한 세포수 측정을 위하여 헤모사이토미터를 사용하였으며 트리판블루 염색약을 이용해 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 일정량의 세포 부유액을 트리판블루와 1:1로 염색한 후 15 μL 추출하여 헤모사이토미터에 넣고 cover glass를 덮은 다음 현미경으로 헤모사이토미터의 눈금에 보이는 단위면적당 세포수를 측정하였으며 자기장 자극 전,후 각각 총 10번 반복실험하여 평균을 나타내었다.

Figure 4. (Color online) Control and PMF groups were dyed with a trypan blue, respectively. Trypan blue and cell culture were mixed at a ratio of 1:1. Extracting 15 μl and putting it in a hemocytometer, the number of living cells was counted. It was repeated more than 10 times using a hemocytometer for comparative analysis.

1. pH 항상성 회복

펄스자기장을 자극한 후 시간 경과에 따른 EM의 pH 확인을 위해 Fig. 2(a)에서 준비된 대조군과 2700 G의 펄스자기장 자극 후 경과된 시간이 각각, 0 h, 2 h, 5 h, 18 h, 24 h 인 PMF 실험군에서 pH 변화를 조사하였다. 펄스자기장을 가하지 않은 대조군보다 PMF 실험군에서의 pH가 더 빠르게 감소함을 Fig. 5를 통해 알 수 있었다. 특히 대조군에서는 24시간 경과후 EM의 pH 변화가 2.7% 이고, 자기장 자극군에는 자극 직후인 0h 와 비교해보면 24h 이후에 4.2% 의 변화가 나타났다. 또한 펄스자기장을 자극한 PMF 실험군이 대조군보다 더 빠르게 정상 pH 범주인 7.35-7.45로 항상성을 회복하는 것을 관찰하였다. 펄스자기장을 자극하고 경과된 시간인 0 h, 2 h, 5 h, 18 h, 24 h에 따라 대조군과 PMF군의 pH 변화율을 보면 각각 0.9, 0.8, 1.2, 1.8, 2.4% 로 펄스자기장을 자극한 후 24시간이 경과시에 2.4%로 가장 크다는 것을 확인할 수 있었다. 펄스자기장 자극 후 경과된 시간에 따른 pH 변화 결과로부터 펄스자기장이 EM의 pH 조절에 영향을 줌으로서 산-염기 항상성 조절이 가능함을 보여주었으며 그 효과가 가장 뚜렷하게 나타난 경우는 펄스자기장 자극 후 24시간이 경과된 후라는 것을 알 수 있었다.

Figure 5. (Color online) The change of pH level according to the elapsed time after PMF stimulation.
Each group was compared with control group. In the PMF stimulation group, homeostasis recovery was faster than in the control group.

세포는 스스로 본래의 항상성을 회복하는 성질이 있어 시간이 지남에 따라 pH가 점차 정상으로 조절되는 것으로 알려져 있는데, Fig. 5의 대조군 실험에서 확인할 수 있다. 그러나 PMF 실험군에 비해 정상으로 회복되는 속도가 느려지는 것으로 보인다.

항상성 조절의 효과가 가장 크게 나타난 경우가 자기장 자극 후 24시간 경과한 후였으므로 자기장의 세기의 최적화를 위해 Fig. 2(b)와 같이 1000 G, 2700 G, 4000 G 세기의 펄스자기장 자극 24시간 후 각 자기장 세기별 pH를 확인하였다. 1000 G의 자기장을 자극한 세포의 pH는 대조군의 pH 7.66에서 7.55로 pH가 감소, 2700 G를 자극한 세포는 7.48, 4000 G를 자극한 세포는 7.38로 감소하였다. 자극한 펄스자기장의 세기가 커질수록 정상 pH인 7.2-7.4로 항상성 조절의 효과가 뚜렷하게 나타난다는 것을 Fig. 6에서 확인할 수 있었다. 이는 일정한 펄스자기장의 pulse transition time인 137.6 μs에서 자기장 세기가 증가할수록 자속변화율이 커짐에 따라 세포막의 이온통로에 더 큰 영향을 주어 막전하의 변화로 인해 H+ 이온화가 활성됨에 따라 pH가 정상범위인 7.4로 근접하는 것으로 해석할 수 있다. 따라서 마우스 림프종 EL4 세포에 강한 펄스자기장을 가한 후 세포의 doubling time이 경과하면 세포의 산-염기 항상성이 회복됨을 알 수 있었다.

Figure 6. (Color online) The pH level of control group, and PMF stimulated group with the PMF strength of 1000, 2700, 4000 G. The homeostasis recovery increased rapidly as magnetic field strength increased.

EL4 세포의 증식률을 측정함으로서 펄스자기장이 T세포의 억제 및 활성 간의 균형에 미치는 영향을 확인하였다. Figure 4에서 준비한 대조군과 실험군에서 트리판 블루 염색을 이용하여 살아있는 세포 수를 헤마토크릿을 이용하여 10회 이상 반복 측정하여 비교분석하였다. Figure 7에서 대조군보다 PMF 실험군에서 세포수가 32%나 감소한 것으로 보아 마우스 림프종 EL4 세포에 펄스자기장을 자극해주어 과도하게 활성된 세포들을 감소시켰음을 알 수 있다. 이는 T세포가 과도하게 활성되면 자가면역질환으로 인한 만성염증이 유발되지만 펄스자기장이 마우스 림프종 EL4 세포 수 감소를 유도하여 면역반응을 개선시킨 것으로 보인다. 따라서 펄스자기장은 항상성 조절뿐만 아니라 면역반응의 균형 유지에도 기여하므로 인체의 병증완화 및 면역반응 개선과 관련하여 매우 중요한 지표로 활용될 가능성을 제시한다.

Figure 7. The control group and the PMF experimental group that stimulated the magnetic field of 4000 G were stained with trypan blue and then counted the number of living cells. respectively. The number of T lymphoma cells decreased in PMF stimulus group than in the control group. PMF stimulus might be inducing the natural death of T lymphoma cells.

본 연구에서는 마우스 림프종 T 세포주인 EL4 세포에 펄스자기장을 자극한 후 EM의 pH변화를 관찰하여 펄스자기장이 면역의 활성수준을 조절하여 면역세포의 억제와 활성을 균형조절함으로서 pH 항상성 회복뿐만 아니라 면역반응을 개선하는 것을 확인하였다. 펄스자기장 자극 전인 대조군에 비해 PMF를 자극한 실험군에서 pH 정상 범주인 7.2-7.4로 항상성이 회복되는 속도가 증가되었고 펄스자기장 자극 후 24시간 경과된 후와 자기장 세기가 증가할수록 그 효과가 뚜렷하게 나타났다. 이는 세포막에서 이온 간의 교류가 활발해지고 염증매개체 방출로 인해 세포외 배지 환경이 충분히 변화하는 시기인 세포의 doubling time 을 충분히 지난 뒤에 자기장의 효과가 발휘되는 것으로 판단된다, 또한 선행연구에서 펄스자기장이 적혈구 막에서 변형성을 결정하는 요인인 Ca2+ 이온 통로에 영향을 주어 적혈구의 응집성과 변형성에 긍정적으로 작용한 것처럼 펄스자기장 세기가 증가할수록 순간적 자속변화율이 커져 세포막의 H+ 펌프 작용에 영향을 주어 H+이온이 활성화 되어 pH 항상성 회복 효과가 나타나는 것으로 판단된다. EL4 세포의 증식률 조사에서 대조군에 비해 PMF 자극군에서 현저하게 세포수가 감소하는 것을 관찰하였는데 이는 펄스자기장 자극이 마우스 림프종 EL4 세포수 감소를 유도하여 세포 면역반응을 개선시킨 것으로 생각된다.

그러므로 펄스자기장 자극의 최적화 조건으로 세포에 자극을 준다면 산-염기 항상성 조절뿐만 아니라 세포의 증식률에도 영향을 미치므로 인체의 병증완화 및 면역반응 개선과 관련하여 펄스자기장을 이용한 비침습적인 의료기기를 개발한다면 항암제와 같은 약물치료의 부작용을 감소시킬 것으로 생각된다. 또한 면역반응의 개선 이외에도 TNF-α, 인터루킨과 같은 사이토카인 확인을 통한 항염증 효과에 대한 연구도 진행된다면 펄스자기장이 인체에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 좀 더 확실하게 규명할 수 있을 것이다.

본 연구의 결과를 확장하기 위해 자기장 세기뿐만 아니라 pulse transition time, 자극 시간, 펄스 모양 등을 최적화할 필요가 있으며 펄스자기장이 인체에 끼치는 영향을 확인하기 위해 먼저 동물실험을 통해 생체 내 실험을 진행하여 펄스자기장의 pH 항상성, 면역반응 개선효과를 확인할 필요가 있다고 생각된다.

이 논문은 교육과학기술부의 재원으로 한국연구재단의 이공분야 기초 연구사업 (NRF-2021R1F1A1060167)의 지원으로 수행한 결과입니다.

  1. I. Cicha, Y. Suzuki, N. Tateishi and N. Maeda, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 2335 (2003).
    Pubmed CrossRef
  2. G. W. Jung, WITH CAP. 8, 56 (2010).
    Pubmed CrossRef
  3. E. M. Behrens, Autoimmun. Rev. 7, 305 (2008).
    Pubmed CrossRef
  4. J. A. Gracie et al, J. Clin. Investig. 104, 1393 (1999).
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. M. G. Rudolph, R. L Stanfield and I. A Wilson, Annu. Rev. Immunol. 24, 419 (2006).
    Pubmed CrossRef
  6. P. A. van der Merwe and O. Dushek, Nat. Rev. Immunol. 11, 47 (2011).
    Pubmed CrossRef
  7. M. Kanje, A. Rusovan, B. Sisken and G. Lundborg, Bioelectromagnetics 14, 353 (1993).
    Pubmed CrossRef
  8. J. H. Son, S. M. Bae and J. H. Sung, Korean J. Orthod. 27, 623 (1997).
  9. J. S. Lee, J. H. Lee, J. K. Shim and W. Hur, Appl. Chem. Eng. 31, 13 (2020).
    CrossRef
  10. D. G. Hwang and H. J. Park, J. Korean Magn. Soc. 30, 162 (2020).
    CrossRef
  11. H. J. Park (2014). Master's thesis. Sanji university, .
  12. S. H. Bang and H. S. Lee, J. Korean Magn. Soc. 30, 139 (2020).
    CrossRef
  13. S. H. Han, J. W. Mok, S. H. Bang and H. S. Lee, New Phys.: Sae Mulli 69, 1147 (2019).
    CrossRef
  14. H. Son, S. Kim, D. G. Hwang and H. S. Lee, IEEE Trans. Magn. 50, 1 (2014).
    CrossRef
  15. S. J. Kim, S. S. Lee and H. S. Lee, J. Korean Magn. Soc. 32, 141 (2022).
    CrossRef

Stats or Metrics

Share this article on :

Related articles in NPSM