금 나노입자(Gold Nanoparticle, GNP)는 다양한 분야에서 중요한 역할을 하는데, 이는 그들이 독특한 물리적, 화학적, 광학적, 그리고 생물학적 특성을 지니기 때문이다[1, 2]. GNP는 우수한 생체 적합성, 화학적 안정성, 그리고 표면 개질이 용이하다는 장점으로 인해 생물의학적 응용에서 특히 주목받고 있다[3]. 이러한 특성은 암 진단, 약물 전달, 바이오센싱, 그리고 광열 치료 등에서 중요한 역할을 하며, 그 중에서도 광열 암 치료(Photothermal cancer therapy)는 GNP의 뛰어난 광학적 특성을 직접적으로 활용하는 대표적인 연구 결과이다[4].

특히 금 나노로드(Gold nanorod; GNR)는 비구형 구조로 인해 금 나노 구체에 비해 더욱 독특한 광학적 특성을 나타낸다. GNR은 종횡비(aspect ratio, AR)에 따라 흡수 및 산란할 수 있는 빛의 파장이 조절되는 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR)을 보여준다[5]. 이러한 SPR 현상은 GNR이 특정 파장의 빛을 강하게 흡수하고, 이 흡수된 빛을 국부적인 열로 변환하는데, 이 과정이 바로 광열 효과(Photothermal effect)이다[6]. GNR이 광열 암 치료에 특히 효과적인 이유는 크게 세 가지 구분할 수 있다.

• 광학적 조절 가능성: GNR은 그 모양에 따라 SPR 파장을 조절할 수 있으며, 이는 인체에 무해한 근적외선(Near-infrared; NIR) 영역에서의 빛을 효과적으로 흡수할 수 있도록 설계될 수 있다[7]. NIR 빛은 생체 조직에서 깊이 침투할 수 있기 때문에, 체내 깊숙한 암세포를 목표로 할 수 있다[8].

• 높은 광열 효율: GNR은 높은 종횡비 덕분에 구형 GNP에 비해 훨씬 더 강력한 광열 변환 효율을 가진다. 이는 더 적은 에너지로도 암세포를 효과적으로 파괴할 수 있음을 의미하며, 주변의 건강한 조직에 가해지는 피해를 최소화하는 데 기여한다[9].

• 생체 적합성 및 표적화 가능성: GNR은 생체 적합성이 우수하며, 표면을 다양한 생체 분자들로 기능화 할 수 있다[10]. 이를 통해 암세포에 선택적으로 결합하는 능력을 받아, 정상 세포에 미치는 영향을 최소화하면서 표적화 광열 치료를 가능하게 한다.

광열 암 치료에 GNR을 보다 낮은 빛 에너지로 효율을 높이기 위해서는 개별 GNR의 SPR 특성을 파악하는 것이 매우 중요하다. 일반적으로 GNR의 흡수 분광 측정에는 앙상블 상태로 진행되어 정확한 스펙트럼 분석 결과를 얻을 수 없다. 특히, 직경이 수십 nm 이하에서는 빛 흡수가 산란보다 우세하여[11], GNP가 흡수한 열은 방출하면서 주변 매질의 온도 변화가 발생되고, 결과적으로 국부적인 지점에서 굴절률 변화를 초래한다[12]. 광열 현미경은 이러한 굴절률 변화를 모니터링하여 개별 GNP를 감지할 수 있는 기술이다[13]. 하지만 기존 공초점 광열 현미경 기술들은 펌프-프로브 빔의 광축 정렬에 크게 의존하고, 이미징 모듈이 단일 포인트 조명과 스캐닝 기반으로 되어 있어 이미지 획득에 시간이 많이 소요된다. 또한 높은 개구수의 대물렌즈를 이용하기 때문에, 관측 시야가 상대적으로 좁아 다수의 GNP 검출에 불리한 측면이 있다. 이에 반해 CCD 카메라를 기반으로 하는 광시야 광열 현미경 기술은 대면적으로 관찰이 가능하기 때문에 다수의 GNP 분석에 매우 유용하다.

본 연구에서는 상용 현미경 장비에 펌프 광원을 결합한 광시야 광열반사 현미경 시스템을 이용하여 종횡비가 서로 다른 GNR의 이미징을 통해 검출 신호 대 잡음비(Signal-to-noise ratio; SNR)를 비교한다. 제안된 시스템은 광축 정렬 의존성을 줄이면서, 다수의 개별 GNR를 대면적 관측 시야에서 감지할 수 있는 간단한 구성을 가지고 있다. 또한, CCD 카메라 기반의 락-인 방식으로 간단한 이미지 처리 방법을 사용함에도 불구하고 개별 GNR을 감지할 수 있는 충분한 민감도를 확보하였다. 더불어 암시야 이미징 기술도 장착되어 있어 광열 실험 수행 전 관측 시야 내의 개별 GNR 외 오염 물질을 구분할 수 있어 측정에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있었다.

1. 실험 구성

Figure 1은 본 연구에서 개발된 광시야 광열반사 현미경 시스템의 실험 구성을 나타내며, 상용 도립 현미경을 기반으로 구축되었다. GNR의 광열 여기(photothermal excitation)를 위해 808 nm 파장을 갖춘 펌프 빔은 1 Hz 주파수로 변조하면서 멀티모드 파이버(multimode fiber), 반사형 시준기(Reflective collimator), 광 감쇠기(Attenuator)를 지나 첫 번째 이색성 거울(1st Dichroic mirror)에 반사되어 GNR 샘플에 도달하게 된다. 펌프 빔으로 여기되어 GNR 주변 매질에 방출되는 열 변화, 즉, 굴절률 변화를 CCD 카메라로 측정하기 위한 프로브 빔으로 현미경에 장착되어 있는 제논 아크 램프(Xenon arc lamp)를 사용하였다. 렌즈 1을 지난 평행 빔은 대역 통과 필터(bandpass filter)에 635 nm 파장 영역만 사용하게 된다. 이후 빔 분배기(Beam splitter)에 의해 반사되고, 현미경 대물렌즈(40배, 0.75 개구수)를 통해 샘플에 초점을 맞춰 시간에 따른 온도 변화를 감지한다. 샘플에 조사된 펌프 빔 영역의 중앙은 프로브 빔 영역의 중앙과 일치하도록 설계되었다. GNR 주변 매질의 국소 영역에서 발생하는 온도 변화에 따라 반사된 프로브 빔의 강도는 변화하는데, 이 빔은 다시 빔 분배기, 두 번째 이색성 거울, 대역 통과 필터와 렌즈 2에 흑백 CCD 카메라(14 bit, 1600 × 1200 픽셀, 635 nm에서 40% 이상의 양자효율)에 도달한다. 단색 CCD 카메라 앞의 대역 통과 필터는 펌프 빔이 카메라에 도달하지 않도록 차단시키기 위함이다. 암시야 이미지는 단색 및 컬러 CCD 카메라에서 모두 획득이 가능하며, 컬러 CCD 카메라로 개별 GNR의 산란 색상을 구별하여 광열 실험을 수행하기 위한 위치를 신속히 선정할 수 있다[4]. 컬러 CCD 카메라에서 획득한 개별 GNR의 암시야 이미지는 단색 CCD 카메라에서 획득한 이미지와 비교하여 광열 실험을 종료한 이후 광열 이미지에서 검출된 개별 GNR과 비교한다.

Figure 1. (Color online) Schematic of the wide-field photothermal reflectance microscopy system.

2. 금 나노로드 샘플 제조 과정

먼저 그리드 커버글라스(Grid coverglass)를 아세톤, 메탄올, 탈이온수로 5분간 세척하여 이물질을 제거하고, 흐르는 탈이온수로 10초 동안 3번 헹군 후, N₂ 가스를 사용하여 남아 있는 물을 제거한다. 그리드 커버글라스를 핫 플레이트(hot plate) 위에 올려놓고, 180 °C에서 20분간 가열하여 남아 있는 수분을 완전히 제거한다. 폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스와 경화제를 10:1의 비율로 2분간 혼합하여 PDMS 용액을 준비한다(Fig. 2(a)). PDMS 용액이 담긴 용기를 데시케이터(Desiccator)로 옮겨 혼합 과정에서 발생한 기포를 완전히 제거한다(Fig. 2(b)). 기포를 제거한 PDMS 용액 2mL을 커버글라스 위에 부은 후, 5000rpm에서 1분간 스핀 코팅한다(Fig. 2(c)). 커버글래스 위에 얇게 코팅된 PDMS 용액을 핫 플레이트에서 80 °C에서 5분 동안 경화시킨다(Fig. 2(d)). 이 후 30 μL의 금 나노로드(GNR) 용액)을 코팅된 PDMS 위에 떨어뜨리고 3000 rpm에서 90초 동안 스핀 코팅하여 GNR을 고르게 분산시키면서 건조한다(Fig. 2(e)). 마지막으로 Fig. 2(c)와 2(d)의 과정을 반복하여 PDMS를 GNR 층 위에 다시 코팅한다(Fig. 2(f)).

Figure 2. (Color online) Gold nanorods sample fabrication process.

3. 광시야 광열반사 이미지 획득을 위한 신호 처리 방법

GNR는 변조 가능한 펌프 빔에 의해 가열되는데, 이 열은 GNR의 주변 매질(PDMS)로 전달되어 온도 구배를 생성한다. CCD 카메라는 변조된 펌프 레이저와 위상 동기화되고, 여기서 주변 매질 온도의 변조 주파수, 즉 반사율의 변조 주파수는 f (1 Hz)이다. 반사율을 식으로 표현하면 다음과 같다[14]:

여기서 φ(x,y)는 변조된 온도로 인한 위상 변이이고, ψ는 신호 변조와 트리거된 카메라 간의 전반적인 지연을 설명하는 임의의 균일한 위상 변이이다. 락-인(lock-in) 방식과 CCD 카메라를 fc=4f 주파수로 트리거링하면 변조된 반사율을 나타내는 2D 이미지를 얻을 수 있다. 만약 fc가 펌프 빔 변조 주파수(f)의 4배로 선택되면, CCD 카메라는 펌프 레이저 변조의 각 주기 동안 4개의 이미지를 획득한다. 변조된 진폭 ΔR(x,y), DC 이미지 R0(x,y), 그리고 상대 위상 φ(x,y)+ψ 는 다음과 같은 관계식으로 얻을 수 있다:

변조된 신호를 DC 신호로 정규화하면 다음 방정식을 통해 반사율의 상대적인 변화를 아래와 같은 식으로 추출할 수 있고, 이러한 호모다인(homodyne) 광학 락-인 측정 기술은 동일한 위상의 다중 이미지를 각 구간(I1,I2,I3,I4)에 축적하여 각 구간의 평균값을 기록하는 방식이다.

CCD 카메라로 수집된 신호에는 시스템에서 본질적으로 발생하는 랜덤 노이즈가 포함되어 있는데, 평균화 이미지의 수를 증가시키면 이러한 노이즈를 감소시킬 수 있다[15]. 본 논문에서는 광시야 광열 반사 현미경 시스템으로 획득한 ΔR/R의 표준편차는 평균화 이미지 수가 200장 이상에서 수렴하였다. 표준편차는 신호가 나타나지 않은 이미지에서 200 × 200 픽셀로 관심 영역을 정의하여 측정되었다. 이와 더불어 광열 반사 이미지를 통해 검출된 개별 GNR을 평가하기 위해 SNR을 추출하였고, 신호(16 × 16 픽셀)의 평균값과 표준편차의 비율로 정의되었다[16].

1. 개별 금 나노로드의 광열반사 이미지 결과

광열 신호를 강화하기 위해서는 굴절률이 온도 변화에 민감한 매질을 선택하는 것이다. 일반적으로 광열 강도(Photothermal strength; n|∂n/∂t|1/Cp)와 성능 지표(Figure of merit; n|∂n/∂t|1/κ)를 획득하여 광열 실험의 적합성을 평가할 수 있는데, 이는 매질의 광학적 및 열적 특성을 나타내는 굴절률(n), 열-광학 계수(Thermo-optic coefficient; |∂n/∂t|), 체적 열 용량(Volumetric heat capacity; Cp), 열 전도도(Thermal conductivity; κ)로 계산할 수 있다[17]. Figure 3은 이전에 보고된 광열 이미징 연구에 사용된 매질의 종류와 본 연구에서 사용된 매질인 PDMS의 광열 강도와 성능 지표를 비교한 그래프이다. 가장 많이 사용된 주변 매질의 종류는 글리세롤(glycerol)[18, 19]로, PDMS의 광열 강도 및 성능 지표가 2배 이상 차이남을 확인하였고, 광열 신호를 획득함에 있어 효율성이 가장 높은 것으로 예측되었다.

Figure 3. (Color online) Comparison of photothermal strength and figure of merit (FOM) of surrounding medium materials.

808 nm 펌프 빔에 의한 광열 여기 효율을 확보하기 위해 흡수 피크 파장이 808 nm와 가깝고 동시에 광열 신호를 검출하는 635 nm 프로브 빔의 여기 효율이 거의 없는 서로 종횡비가 다른 GNR을 선정하였다. Figure 4는 종횡비가 서로 다른 4가지 GNR의 흡수 스펙트럼과 크기 분포를 확인한 결과이다. 흡수 스펙트럼은 앙상블 상태에서 측정되었으며, Figure 4(a)–4(d)에서 그 결과를 보이며 펌프 빔(Fig. 4(a)–4(d)의 초록색 점선)에서의 여기 효율이 높은 반면 프로브 빔 (Fig. 4(a)–4(d)의 빨간색 점선) 파장 영역에서는 거의 없음을 확인할 수 있다. Figure 4(e)–(f)는 GNR의 크기 분포를 보이며, 종횡비는 각각 3.71, 3.95, 4.19, 4.65 이다. 크기 측정은 Fig. 4(e)–(f)의 각각에 삽입된 투과 전자현미경 사진을 활용하였다. 광열 실험 결과를 비교하기 위해 종횡비가 작은 순서대로 하여 GNR #1–#4로 명명하였다.

Figure 4. (Color online) Ensemble extinction spectra of (a) 3.71, (b) 3.95, (c) 4.19, and (d) 4.65 aspect ratio (AR) of GNRs. Solid lines indicate experimental spectra, dashed red and green lines correspond to the probe and pump wavelengths of 635 and 808 nm, respectively. AR distributions of GNRs are (e) 3.71, (f) 3.95, (g) 4.19, and (h) 4.65. Insets are representative transmission electron microscopy images. The distributions are presented in panels (e)–(h), with the numbers of GNRs, AR means, and standard deviations indicated.

광열 실험을 수행하기 전에 암시야 이미징은 신호 대 잡음 비율이 낮아 명시야 이미지에서 관찰하기 어려운 100 nm 이하의 나노입자를 샘플 내에서 개별 GNR가 분포된 영역을 선정하는 데 사용된다. 일반적으로 나노입자의 크기 및 형태를 정확하게 관찰하기 위해서 주사 전자현미경이나 투과 전자현미경을 사용하지만, GNR의 종횡비에 따라 SPR 파장을 특정할 수 있어 광열 이미징으로 검출된 GNRs의 분포를 암시야 이미징으로 획득한 결과에서 산란된 빛의 색상과 강도를 기반으로 GNRs를 구별하여 실험 과정을 간소화할 수 있다[20]. 암시야 이미지는 두 가지 유형의 카메라를 사용하여 획득한다. 먼저, 컬러 CCD 카메라에서 개별 GNR에서 산란된 빛의 색상을 확인하고 광열 실험을 수행할 영역을 선택한다. 이 후 선택된 컬러 암시야 이미지와 동일한 관심 영역을 단색 CCD 카메라로 동일한 영역인지 재확인하고, 광열 실험을 수행한다.

Figure 5는 광시야 광열반사 현미경 시스템을 이용한 광열 실험 결과를 나타낸다. 앞서 언급한 설명한 바와 같이 반사 이미지 내에서는 개별 GNR이 관찰되지 않았다(Fig. 5(a)). 반면, 암시야 이미지인 Fig. 5(c)와 5(d)에서는 산란된 빛을 발하는 개별 GNRs를 관찰할 수 있다. 특히, GNRs는 Fig. 4에서 흡수 스펙트럼 측정 결과에서 보이듯이 적색 파장에 가까운 근적외선 영역대에 분포하고 있어, 산란 빛이 적색을 띄고 있다(Fig. 5(c)). 단색 CCD 카메라로 획득한 암시야 이미지 내에 분포하고 있는 GNRs 분포 결과(Fig. 5(d))는 컬러 이미지와 동일함을 확인할 수 있다. Figure 5(b)는 광열반사 이미지로 펌프 빔에 의한 프로브 빔의 반사율 변화를 측정한 결과이다. 광열반사 신호는 암시야 이미지에서 관찰된 GNRs와 동일한 위치에서 검출됨을 입증한다. Figure 5의 이미지들은 실제 측정 영역(240 μm × 180 μm)을 확대한 것이다. 광열반사 신호의 신뢰성을 확보하기 위해 펌프 빔의 강도를 증가시키며 광열 실험을 수행하였다. 펌프 빔의 강도가 증가함에 따라 광열반사 신호가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

Figure 5. (Color online) Wide-field photothermal microscopy for individual GNP detection. (a) Reflection image of GNR sample. The low signal-to-noise/background ratios hinder the observation of GNRs on the sample. (b) Photothermal reflectance image of the GNR sample area shown in (a) acquired by a 808 nm pump beam with a heating intensity of 1.3 kW·cm² and modulation frequency of 1 Hz. (c) Color and (d) monochrome dark-field imagea of the GNR sample area shown in (a). The positions of individual GNRs that could not be observed in the reflection image can be determined. The area within the white circle in (a) probable shows a GNR cluster.

광시야 광열반사 현미경 시스템으로 개별 GNR을 충분히 검출할 수 있음을 검증하였고, 종횡비가 서로 다른 GNR을 구별할 수 있는지 확인하기 위해 펌프/프로브 빔의 강도와 평균화 이미지 수의 실험 조건을 동일하게 적용하여 추가적인 광열 실험을 수행하였다. Figure 6은 종횡비가 서로 다른 GNRs의 광열반사 이미지와 검출된 개별 GNR의 신호를 평가한 결과이다. Figure 6(a)–(d)는 종횡비가 각각 3.71, 3.95, 4.19, 4.65인 GNR의 광열반사 이미지로, 관심 영역 내에서 주변 배경 대비 신호가 강함을 확인할 수 있다. 검출된 개별 GNR의 광열반사 신호를 평가하기 위해 서로 다른 종횡비를 갖는 GNR의 광열반사 이미지 내에서 하나의 GNR를 선택하여 광열반사 신호 선 프로파일을 Fig. 6(e)–(f)에서처럼 나타낸다. Figure 6(e)–(f) 내에 삽입된 이미지는 각 종횡비에 대응하는 하얀색 사각 박스의 개별 GNR 광열반사 신호를 확대하여 나타낸 것이다. 광열 실험에 앞서 종횡비가 서로 다른 GNR의 흡수 스펙트럼을 측정한 결과를 Fig. 4에서 설명하였고, 펌프 빔에 의한 광열 여기 효율은 종횡비가 3.95(GNR #2)와 4.19(GNR #3), 3.71(GNR #1)과 4.65(GNR #4)가 서로 비슷하였다. 실제 GNR #2와 #3의 신호 선 프로파일을 살펴보면, 신호 강도가 거의 비슷하였다. 하지만, GNR #1과 #4의 결과는 종횡비가 가장 큰 GNR #4에서 광열 신호가 가장 약했다. GNR의 SPR 파장은 주변 매질의 굴절률에 의해 민감하게 변한다. Figure 4에서 측정된 흡수 스펙트럼은 주변 매질의 종류가 물이었고, 이는 PDMS에 비해 굴절률이 작다. 실제 이전에 보고된 결과에 따르면 나노입자 주변 매질의 굴절률에 따라 나노입자의 SPR 파장은 굴절률이 증가함에 따라 적색 편향되었다[21]. 결과적으로 주변 매질의 환경이 물(1.33)에서 PDMS(1.43), 즉, 굴절률이 증가함에 따라 SPR 파장이 적색 편향되어 펌프 빔 파장에서 광열 여기 효율은 GNR #1에서는 증가한 반면 GNR #4에서는 감소되었다.

Figure 6. (Color online) Photothermal reflectance images of (a) 3.71, (b) 3.95, (c) 4.19, and (d) 4.65 aspect ratio (AR) of GNRs. Photothermal signal line profiles of GNRs are (e) 3.71, (f) 3.95, (g) 4.19, and (h) 4.65. (e) 3.71, (f) 3.95, (g) 4.19, and (h) 4.65. Insets represent the white box in the photothermal reflectance images of (a)–(d).

SPR 파장 편향을 보다 정확하게 조사하기 위해 광열반사 이미지 내에서 검출된 종횡비가 서로 다른 개별 GNR들의 SNR을 평가하였다. Figure 5(a)의 반사 이미지 내 하얀색 원 안에서 관찰되는 것은 GNR 집합체 또는 오염 물질로 예측된다. Figure 5(b)–(d)의 광열반사 및 암시야 이미지 내에서도 신호 강도가 주변 다른 개별 GNR에 비해 강하게 나타내는 것으로 보아, GNR 집합체일 것이다. 대면적 광열반사 이미지 내에서 검출된 개별 GNR의 SNR을 평가할 때, 앞서 언급한 GNR 집합체들은 제외시켰다. Figure 7은 대면적 광열반사 이미지 내에서 검출된 개별 GNR의 SNR을 계산한 결과를 나타낸다.

Figure 7. (Color online) Histograms representing the SNR of individual GNRs detected in photothermal reflectance images for aspect ratios (AR) of (a) 3.71, (b) 3.95, (c) 4.19, and (d) 4.65. The distributions for each AR are shown in panels (a)–(d), with the mean SNR and standard deviations indicated. (e) The relationship between the aspect ratio of GNRs and the average SNR of individual GNRs in the photothermal reflectance images.

Figure 7(a)–(d)는 282개의 개별 GNR의 SNR을 종횡비가 증가하는 GNR #1–#4의 순서로 나타낸 히스토그램이다. 히스토그램 결과의 개형은 Fig. 4에서 보이는 크기가 서로 다른 각각 GNR들의 종횡비 분포와 비슷하다. 각 종횡비에서 조사한 SNR의 평균과 표준편차를 Fig. 7(e)에서 설명한다. 앞선 단락에서 예상했듯이, SPR 파장이 적색 편향되어 GNR #1과 #4의 평균 SNR이 각각 증가 및 감소했음을 입증하였다.

본 연구에서는 상용 현미경으로 설계된 광시야 광열반사 현미경 시스템을 활용하여 다양한 크기의 나노입자 검출이 가능성을 제시하였다. 이 시스템은 두 종류의 CCD 카메라와 펌프 빔만 일반적인 현미경에 장착하여 간단하게 광열 이미징이 기능을 구현할 수 있다. 게다가 정밀하고 복잡한 광학 정렬이 필요 없기 때문에 개별 나노입자를 검출하고 분석할 수 있는 중요한 장점을 제공하여 광학 시스템에 대한 전문 지식이 없는 사용자에게도 접근성이 높다. 특히, 다양한 크기 및 형상의 나노입자 합성을 연구하는 분야에 합성 결과물을 신속히 평가할 수 있는 시스템으로 적극 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서 제안한 시스템으로 단일 파장의 펌프 빔만 이용하더라도 종횡비가 서로 다른 나노입자 구별의 가능성을 평가하였고, 그 결과가 예상되는 범위에서 값을 도출할 수 있었다. 향후 연구에서는 파장 가변이 가능한 펌프 빔을 활용하여 보다 다양한 형상의 나노입자의 특성 분석이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구는 2024년도 한국한의학연구원 “한의이론 기반 스마트 건강노화 관리기술 개발 (KSN2312022)” 과제의 지원을 받아 수행된 연구결과입니다.